聚合酶鏈反應(yīng) （PCR） 是一種實驗室核酸擴增技術(shù)，用于使用 DNA 聚合酶 I 酶對脫氧核糖核酸 （DNA） 或核糖核酸 （RNA） 序列的短片段進(jìn)行變性和變性。1985年，Mullis及其同事引入了PCR，并因此獲得了諾貝爾獎。它是生物分子科學(xué)中用于不朽的工具，因為它具有檢查和檢測 DNA 擴增成分的強大能力。
PART 1
基礎(chǔ)知識（PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR）
PCR：普通的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction , PCR)），以雙鏈DNA為模板，以dNTP為底物，特異性地擴增雙鏈DNA。然后采用瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行檢測，只能做定性分析。
qPCR：實時熒光定量PCR （real-time PCR, or qPCR），以cDNA為模板，以dNTP為底物，對擴增出的DNA進(jìn)行定量分析。實時熒光定量PCR常用的方法：水解探針法和熒光染料法。
RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR），將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增相結(jié)合，是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將一條單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。
RT-qPCR：實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, or RT-qPCR），是qPCR+RT-PCR的組合，將總RNA或mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后再作為模板，以dNTP為底物，進(jìn)行qPCR的定量分析。
PART 2
基礎(chǔ)流程（PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR）
PCR流程：
變性Degeneration ：雙螺旋的氫鍵斷裂而變性解鏈變成單鏈DNA，成為合成DNA的活性模板；
退火Annealing：引物與模板DNA單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，形成局部雙鏈；
延伸Elongation：按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。
在經(jīng)歷一次變性→退火→延伸的流程之后，原本只有1條的DNA雙鏈變成了2條；2次之后是4條；以此類推，經(jīng)過變性、退火和延伸重復(fù)若干個循環(huán)后，就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
qPCR流程及分類：
qPCR在整個擴增的過程中，引入了熒光染料或者熒光基團，隨著DNA數(shù)量的成倍增加，反應(yīng)體系中的熒光信號也會增強。借助對熒光信號的強弱進(jìn)行檢測實時監(jiān)測每一個循環(huán)中擴增產(chǎn)物量的變化，*后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值對待測檢測樣品進(jìn)行定量分析。
目前根據(jù)不同的熒光物質(zhì)，我們可以大致將qPCR分為兩種：熒光染料和探針法；
熒光染料：
主要為SYBRGreenⅠ染料，該染料能與DNA雙鏈結(jié)合，結(jié)合之后會顯示熒光信號，而在沒有結(jié)合的時候幾乎檢測不到熒光信號，隨著拷貝數(shù)的增加，熒光信號增強。
優(yōu)點：價格較低；使用方便；對DNA模板沒有選擇，通用性好；檢測靈敏度高。
缺點：可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，需要通過熔解曲線分析識別擴增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴增；不適合進(jìn)行多重qPCR檢測。
TaqMan探針法：
其原理是根據(jù)目的基因設(shè)計一個能與之特異性結(jié)合的熒光探針，該探針包含兩個基團：一個熒光基團和一個淬滅基團，正常情況下因為淬滅基團的存在導(dǎo)致熒光基團無法發(fā)出熒光，而在擴增時探針結(jié)合到DNA的模板上，并且擴增到探針位置時兩個基團被切開，從而熒光基團可以發(fā)出熒光，同樣隨著拷貝數(shù)的增加，熒光信號增強。
優(yōu)點：檢測特異性強；靈敏度高；適合進(jìn)行多重qPCR檢測；PCR后續(xù)無需處理，節(jié)省時間和原料成本。
缺點：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針；探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性，定量時容易受試劑和酶性能影響；淬滅難以徹底，成本較高；檢測結(jié)果很難判斷實際的擴增特性。
RT-PCR流程：
反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription - PCR，RT-PCR），是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形。RT-PCR 結(jié)合了反轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的過程。
該技術(shù)的一般過程為，首先以RNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成其對應(yīng)cDNA，再以cDNA為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴增。歸根結(jié)底，其就是在PCR過程前加了一個反轉(zhuǎn)錄過程，之后即可進(jìn)行普通PCR。
RT-qPCR流程及分類：
RT-qPCR是qPCR和RT-PCR的組合，因為RT-PCR只可以定性，但不能進(jìn)行定量分析。與RT-PCR一樣，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進(jìn)行，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進(jìn)行。
一步法：
一步法RT-qPCR把逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴增結(jié)合在一起，使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物。
優(yōu)點：
1. 由于兩步反應(yīng)都在一個管中完成，因此該方法具有更少的實驗誤差；
2. 更少的移液步驟能夠減少污染的風(fēng)險；
3. 適用于高通量擴增/篩選，快速且可重現(xiàn)性高。
缺點：
1. 無法分別對兩步反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化；
2. 由于反應(yīng)條件是結(jié)合兩步反應(yīng)折中得到的，因此靈敏性不如兩步法；
3. 單一樣品檢測的靶點數(shù)較少。
兩步法：
在兩步法RT-qPCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增過程是在兩個管中完成，使用不同的優(yōu)化的緩沖液、反應(yīng)條件、以及引物設(shè)計策略。
優(yōu)點：
1.能夠建立可以長期保存，并用于多次反應(yīng)的穩(wěn)定的cDNA庫；
2. 靶基因和內(nèi)參基因能夠從同一個cDNA庫進(jìn)行擴增，而不需要多重cDNA庫；
3.能夠優(yōu)化單一反應(yīng)過程的反應(yīng)緩沖液和反應(yīng)條件；
4. 靈活的引發(fā)條件選擇。
缺點：
1. 使用多個試管，以及更多的移液步驟會增加DNA污染的風(fēng)險，并且耗時；
2. 相較于一步法，需要進(jìn)行更多的優(yōu)化。
PART 3
總結(jié)及產(chǎn)品推薦
總結(jié)：
PCR、qPCR、RT-PCR和RT-qPCR這四種技術(shù)的主要區(qū)別在于它們的應(yīng)用領(lǐng)域和檢測目標(biāo)不同。PCR主要用于DNA序列的擴增和檢測；qPCR可以實時定量檢測DNA或cDNA的含量；RT-PCR主要用于RNA分子的擴增和檢測；而RT-qPCR則結(jié)合了RT-PCR和qPCR的技術(shù)，可以對RNA分子進(jìn)行定量分析。
產(chǎn)品推薦：
PCR試劑：
qPCR/RT-qPCR試劑：
PCR相關(guān)耗材：
PART 4
參考文獻(xiàn)
[1] Ramesh R, Munshi A, Panda SK. Polymerase chain reaction. Natl Med J India. 1992 May-Jun;5(3):115-9.
[2] Lorenz TC. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. 2012 May 22;(63):e3998.
[3] Ghannam MG, Varacallo M. StatPearls [Internet]. StatPearls Publishing; Treasure Island (FL): Jul 30, 2023. Biochemistry, Polymerase Chain Reaction.
[4] Artika IM, Dewi YP. Real-Time Polymerase Chain Reaction: Current Techniques, Applications, and Role in COVID-19 Diagnosis. Genes (Basel). 2022 Dec 16;13(12):2387.
