測(cè)序文庫(kù)的定量分析和質(zhì)量評(píng)價(jià)對(duì)于獲得高質(zhì)量的核酸測(cè)序數(shù)據(jù)十分關(guān)鍵。因?yàn)椋?/span> 1.如果測(cè)序文庫(kù)拷貝數(shù)偏低，將不能獲得足夠的測(cè)序數(shù)據(jù)，導(dǎo)致降低數(shù)據(jù)產(chǎn)出; 2.如果測(cè)序文庫(kù)拷貝數(shù)過(guò)高，將產(chǎn)生低質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)，甚至?xí)?dǎo)致測(cè)序失敗。 因此，要控制NGS測(cè)序儀上測(cè)序文庫(kù)的載入量，保證測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，就需要在測(cè)序前對(duì)DNA測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行定量分析。 常用的文庫(kù)定量方法有紫外分光光度法、熒光染料法以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。 紫外分光光度法★ 核酸，包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基以及堿基構(gòu)成。其中，由于堿基含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，因此具有紫外吸收的特性。核酸的紫外吸收峰在260nm處，與此同時(shí)，還能通過(guò)計(jì)算A260/A280和A260/A230的數(shù)值，估計(jì)核酸的純度。（280 nm吸光通常來(lái)自蛋白質(zhì)，而230 nm則通常來(lái)自糖類和苯酚等）。 但是紫外分光光度法無(wú)法區(qū)分DNA和RNA，因?yàn)榫哂凶贤馕盏慕Y(jié)構(gòu)是核酸的堿基，而DNA和RNA均含有堿基，因此當(dāng)一份樣品同時(shí)含有DNA和RNA的時(shí)候，測(cè)定濃度會(huì)高于其真實(shí)濃度。 熒光染料法 ★ 使用靶標(biāo)特異性染料，該染料可以特異地與不同種類的核酸鏈相結(jié)合，并在特定波長(zhǎng)光源的激發(fā)下，發(fā)出熒光。其中，結(jié)合了核酸的熒光染料，相比那些游離的，信號(hào)可增幅數(shù)十倍至數(shù)百倍，因此可以和背景區(qū)分開(kāi)來(lái)。在測(cè)量過(guò)程中，首先將待測(cè)DNA樣品與熒光染料混合，熒光染料會(huì)與DNA結(jié)合，形成熒光復(fù)合物。然后，將混合物放入Qubit測(cè)量?jī)x器中，儀器會(huì)通過(guò)激光激發(fā)熒光復(fù)合物，使其發(fā)出熒光信號(hào)。Qubit測(cè)量?jī)x器會(huì)根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度自動(dòng)計(jì)算出DNA的濃度，基本是測(cè)序?qū)嶒?yàn)室的標(biāo)配儀器。 目前，雙鏈和單鏈DNA、RNA及蛋白質(zhì)均有特異的熒光染料，無(wú)需專門(mén)純化樣品，或者在未知污染程度的情況下，使用Qubit可以方便地得知濃度信息。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 ★ qPCR法利用熒光檢測(cè)技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化情況，反映濃度的變化，*后通過(guò)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知樣品的濃度，以達(dá)到準(zhǔn)確定量文庫(kù)濃度。由于其特異性引物僅會(huì)定量?jī)啥私宇^連接完整的文庫(kù)，可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾，因此qPCR法作為文庫(kù)定量的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確性**。 文庫(kù)定量時(shí)，Qubit定的是樣本中所有核酸dsDNA的濃度（以dsDNA為例），包含未連接接頭的dsDNA片段，不能很好地體現(xiàn)出文庫(kù)中有效文庫(kù)的實(shí)際濃度，其結(jié)果一般不作為終濃度用于上機(jī)。而qPCR僅測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)的文庫(kù)序列，非標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)序列占比較大會(huì)導(dǎo)致Qubit測(cè)定值高于qPCR濃度值。 結(jié)論： 基于紫外分光光度的測(cè)定方法相對(duì)不夠精準(zhǔn)定量，更適用于檢測(cè)提取后核酸的濃度。Qubit檢測(cè)的**度略低，但快速的檢測(cè)流程和包含的定量軟件使其成為文庫(kù)常規(guī)定量的理想選擇?；趒PCR的檢測(cè)方法的**度更高，是目前業(yè)內(nèi)進(jìn)行文庫(kù)定量*推薦的方法，適用于測(cè)量珍貴樣本以及文庫(kù)上機(jī)pooling前的精準(zhǔn)定量。 杭州沃森文庫(kù)定量產(chǎn)品推薦
